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Biophysique moléculaire

Biophysique moléculaire

RESPONSABLE DE PLATEAU

Catherine BIRCK

La caractérisation biophysique est une étape centrale dans la compréhension des propriétés intrinsèques et d’interaction des protéines. La plateforme propose un panel d'équipements de pointe et une expertise pour le contrôle qualité et l’analyses fonctionnelle des protéines.

Ingénieur(eure)s

Ultracentrifugation analytique (AUC)

L'AUC (Analytical UltraCentrifugation) permet la caractérisation de macromolécules et de processus d'auto- et d'hétéro-association macromoléculaires en solution. Deux types d'expériences complémentaires, vitesse de sédimentation et équilibre de sédimentation, peuvent être réalisées dans une ultracentrifugeuse analytique qui est une centrifugeuse à grande vitesse équipée d'un système de détection optique. L'observation de la sédimentation de macromolécules ou de complexes macromoléculaires donne accès des paramètres hydrodynamiques et thermodynamiques, notamment la taille, la forme, la masse molaire, le degré d'hétérogénéité, l’état oligomérique, la stoechiométrie et la constante d’affinité des complexes.
 

Instrument : Proteomelab XL-I (Beckman) avec détection en absorbance et interférence

 

 

Analyse de diffusion (FIDA)

FIDA (Flow-induced Dispersion Analysis) combine l'analyse de dispersion de Taylor (TDA) et la détection de fluorescence dans des capillaires pour mesurer la taille des molécules, permettant une détermination précise du rayon hydrodynamique (Rh) des biomolécules et une caractérisation des interactions biomoléculaires basée sur la taille. Les espèces de Rh entre 0,5 et 1000 nm peuvent être analysées et différentes populations résolues. Des changements de taille de 5% du Rh peuvent être détectés. Pour la caractérisation des complexes biomoléculaires, les mesures à différentes concentrations d'analyte (= partenaire de liaison non fluorescent) et à concentration constante de l'indicateur (= biomolécule fluorescente) donnent une courbe de liaison à partir de laquelle la constante de dissociation Kd et le Rh de l'indicateur et du complexe sont obtenues. Les mesures utilisant Fida1 peuvent être effectuées dans le plasma, le sérum, le lysat cellulaire et les milieux de fermentation.

 

 

Calorimétrie de titration isotherme (ITC)

L'ITC est utilisé pour étudier tous les types d'interactions protéiques, y compris les interactions protéine-protéine, protéine-ADN/ARN et protéine-petite molécule. Le système mesure directement la chaleur libérée ou absorbée lors des événements d’interaction. L'isotherme de liaison résultant des injections du partenaire de liaison dans la cellule échantillon permet de calculer l'affinité de liaison (KD), la stoechiométrie (n), l'enthalpie (ΔH) et l'entropie (ΔS).


Equipement : ITC200 (MicroCal)

 

 

Thermophorèse à micro-échelle (MST)


La thermophorèse à micro-échelle (MST) est une méthode d'analyse quantitative des interactions biomoléculaires. La technique est basée sur le mouvement des molécules dans un gradient de température, mesurés par des changements de fluorescence pour déterminer les affinités de liaison. La thermophorèse d'une protéine dépend fortement de propriétés moléculaires telles que sa taille, sa charge, sa couche d'hydratation ou sa conformation et elle va différer de manière significative de la thermophorèse d'un complexe formé avec cette protéine. Cette méthode est rapide et sensible, sans limitation de taille des molécules en interaction.


Equipement : Nanotemper Monolith NT.115 avec canaux de fluorescence rouge et bleu

 

 

Chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière (SEC-MALS)


La chromatographie d'exclusion stérique (SEC) couplée à la diffusion de la lumière multi-angle (MALS) est une technique simple pour déterminer la masse molaire et la taille des protéines et des complexes macromoléculaires en solution. Elle va ainsi permettre de déterminer l’état d’oligomérisation et la stoechiométrie de différents types d’hétéro-complexes, protéine/protéine, protéine/ADN, protéine/ARN et protéine/détergent.  


Equipements :

  • détecteur de diffusion de lumière multi-angles miniDAWN TREOS ;
  • module QELS pour la mesure du rayon hydrodynamique ;
  • réfractomètre Optilab T-rEX (Wyatt Technology) ;
  • système de chromatographie Ettan MicroLC (GE Healthcare).

Fluorimétrie à balayage différentiel (NanoDSF)


La fluorimétrie à balayage différentiel (NanoDSF) est une méthode en solution et sans marquage qui est utilisée pour déterminer la stabilité thermique des protéines et étudier les facteurs affectant cette stabilité. Lors de la dénaturation thermique, les propriétés photo-physiques des acides aminés tryptophane de la protéine sont altérées. L'instrument analyse le déplacement du signal de fluorescence intrinsèque des tryptophanes de 330 nm à 350 nm pour déterminer la température de dénaturation/fusion des protéines (Tm). Un détecteur de diffusion de lumière permet de suivre la formation d'agrégats au cours de la dénaturation des protéines. La technique nanoDSF est simple et rapide, et permet de cribler des conditions optimales de tampon pour les protéines purifiées, des cofacteurs et des ligands potentiels. L'optimisation des propriétés de solubilité et de stabilité des protéines est une étape importante dans la réussite de leurs études structurales. De plus, les changements dans la stabilité thermique des complexes protéine-ligand ou protéine-peptide par rapport à la stabilité de la protéine seule permettent d'identifier rapidement des complexes prometteurs.


Equipement : Nanotemper Prometheus NT.48 avec optique de détection d'agrégation