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Préparation d'échantillons

Préparation d’échantillon

RESPONSABLE DE PLATEAU

Catherine BIRCK

La préparation des échantillons est une étape cruciale pour mener à bien des études structurales et fonctionnelles sur des macromolécules biologiques. La plateforme offre des infrastructures de pointe pour l'expression et la production de biomolécules et de leurs complexes. Nous proposons l'expression de protéines recombinantes et de complexes multiprotéiques chez des hôtes procaryotes et eucaryotes ainsi que la production de biomasse pour obtenir des protéines peu abondantes et des complexes endogènes.

Ingénieur(eure)s

Technicien(ne)s

Préparation des échantillons

Bactéries

Nous proposons :

  1. un large choix de vecteurs d'expression pour Escherichia coli ;
  2. des protocoles parallélisés, qui permettent un criblage de l'expression des protéines solubles grâce à l'utilisation de différentes protéines de fusion et de diverses conditions de croissance ;
  3. la reconstitution et la production de complexes protéiques par multi-expression dans Escherichia coli.

La plateforme est équipée d'incubateurs à agitation et température contrôlées ainsi que de deux fermenteurs (30 et 100 L) pour la culture de bactéries et de levures qui peuvent être utilisés lorsqu'une expression recombinante à grande échelle est nécessaire ou pour la production de biomasse en vue de la purification des protéines/complexes endogènes.

Cellules d’insectes

Le système d'expression baculovirus est utilisé pour la production des protéines et de complexes multiprotéiques dans les cellules d'insectes. Des procédures simplifiées sont proposées pour :

  1. la génération de baculovirus recombinant (transfections, co-transfections) et l'amplification d'un stock viral à titre élevé ;
  2. l'évaluation du baculovirus recombinant et l'optimisation de l'expression à l'aide de cellules ou de suspensions adhérentes ;
  3. l'expression des protéines à diverses échelles et formats, y compris la production de complexes multiprotéiques.

L'installation est équipée d'un environnement dédié à la production de baculovirus avec une salle à température contrôlée à 27°C et un ensemble d'agitateurs permettant à la fois le criblage d'expression et les productions à grande échelle à l'échelle de 1 à 6 litres.

Cellules de mammifères

 L’expression dans les cellules de mammifères est basée sur :

  1. la transfection transitoire ;
  2. l’utilisation du système virus de la Vaccine. La surexpression des protéines est obtenue dans des cellules de hamster BHK21 à l'aide d'un vecteur du virus de la vaccine atténué (Modified Vaccinia Virus Ankara-MVA qui est sans danger pour l'utilisateur et peut être manipulé dans des conditions BSL-1). Les gènes d'intérêt sont clonés en aval d'un promoteur du bactériophage T7 dans un plasmide spécialisé pour le transfert dans le génome viral par recombinaison homologue in vivo. Les virus recombinants sont isolés en quelques semaines par une série d'étapes de sélection utilisant des marqueurs fluorescents. Des recombinants viraux sont ensuite utilisés pour produire des protéines dans des cultures en suspension.

La plateforme est équipée pour des productions de 10 à 20 litres de cellules de mammifères, permettant à la fois une expression recombinante à grande échelle et une production de biomasse pour l'isolement de protéines/complexes endogènes (exprimés dans des conditions physiologiques sous le contrôle de leurs promoteurs naturels).

Dans le cadre d'un partenariat avec la plateforme TacGene du Muséum d'Histoire Naturelle (Paris, France), la plateforme donne également accès à l’utilisation de l’outil d’ingénierie du génome CRISPR-Cas9 pour l'introduction de tags d'affinité permettant de faciliter la purification de complexes endogènes ou pour le marquage des protéines avec des tags fluorescents en vue d'applications d'imagerie et de protéomique fonctionnelle.

 

 

 

 

Purification des protéines

Systèmes de lyse

Plusieurs méthodes de lyse cellulaire sont couramment utilisées pour extraire les protéines d’intérêt : lyse mécanique par cisaillement ou pression, lyse chimique, sonication utilisant des ondes sonores à haute fréquence, choc osmotique et cycles de congélation/décongélation. Le choix de la méthode de lyse dépend du type de cellules (bactéries, levures, cellules de mammifères...), du volume de suspension cellulaire et de la fragilité des protéines à récupérer. La composition du tampon de lyse est également cruciale pour maintenir les protéines d'intérêt dans la fraction soluble après la lyse cellulaire. La plateforme est équipée de sonicateurs et d’homogénéisateurs haute pression.

Equipements :

  1. appareil de dispersion Ultra-Turrax T25 ;
  2. sonicateurs avec petite sonde ;
  3. grande sonde et sonde 4 pointes ;
  4. homogénéisateurs haute pression Emulsiflex C3 et Microfluidizer.

Systèmes de purification

La purification des protéines consiste en une série d'étapes de séparation destinées à isoler un seul type de protéine à partir d'un mélange complexe. Les étapes de séparation peuvent exploiter les différences de taille, de propriétés physico-chimiques, d'affinité de liaison et d'activité biologique des protéines. La purification est réalisée sur des colonnes (échelle préparative ou analytique) à l'aide d’un système chromatographique. Les protéines purifiées seront utilisées pour des études structurales et fonctionnelles ultérieures. Pour évaluer les niveaux d'expression de petites cultures tests et pour cribler l’expression de protéines solubles, une purification partielle à l'aide d'une seule étape d'affinité peut être effectuée à l'aide d'une méthode semi-automatisée utilisant les cônes d’affinité PureSpeed.


Equipements :

  1. système chromatographique Akta Avant ;
  2. pipette multicanaux Rainin E4 XLS ;
  3. cônes d’affinité PureSpeed.