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Oncoprotéines virales et réseaux domaines-motifs

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Oncoprotéines virales et réseaux domaines-motifs

DÉPARTEMENT

Biologie structurale intégrative

CHEF D'ÉQUIPE

Gilles TRAVE

La plupart des fonctions biologiques émergent de réseaux d'interactions complexes impliquant les trois catégories de macromolécules transmises génétiquement- l'ADN, l'ARN et les protéines (le génome, le transcriptome et le protéome) - ainsi que toutes les autres espèces moléculaires (le métabolome). Au niveau atomique, les interactions moléculaires peuvent être représentées par leur structure (approche de biologie structurale à haute résolution). Au niveau interactomique, les interactions peuvent être décrites par leurs énergies libres de liaison ou affinités (approche d'interactomique quantitative). Dans notre équipe, nous développons des approches innovantes pour étudier la structure, les énergies de liaison et les conséquences fonctionnelles des interactomes médiés par les protéines, et ce à l’échelle des systèmes. Nous appliquons ces approches à l'étude de thématiques particulières d'intérêt biomédical : les cancers induits par les papillomavirus, certains troubles neurodéveloppementaux rares et les récepteurs nucléaires aux stéroïdes.

Projets en cours

L'équipe mène à bien 6 axes de recherche différents qui sont décrits ci-dessous.

1. Interactomique structurale et inhibition des oncoprotéines d’HPV

Gilles Travé, Alexandra Cousido-Siah, Mariel Donzeau

E6 est une petite oncoprotéine (150 résidus environ) produite par les papillomavirus humains (HPV) responsables de divers cancers muqueux et cutanés. E6 possède des propriétés pro-prolifératives et anti-apoptotiques dûes à son large interactome avec les protéines de l'hôte (humain). Ces caractéristiques varient considérablement selon le type de HPV, le tropisme (muqueux ou cutané) ou le risque oncogène (à haut risque ou à faible risque). Les protéines E6 des HPV muqueux à haut risque, impliquées dans les cancers du col de l'utérus, de l'anus et de la tête et du cou, se lient en particulier à l'E3 ubiquitine ligase humaine Ube3A et au suppresseur de tumeur pro-apoptotique p53, ce qui conduit à l'ubiquitination puis à la dégradation par le protéasome de p53. Cela favorise la prolifération précoce des cellules infectées par le HPV, ce qui est bénéfique pour l'infection virale. E6 se lie également à une variété d'autres protéines contenant soit des motifs "LxxLL", souvent impliqués dans la transcription, soit des "domaines PDZ", impliqués dans la transduction du signal, l'adhésion cellulaire, la polarité cellulaire ou l'apoptose. Après phosphorylation, E6 se lie également aux protéines "phospho-reader" 14-3-3.

Dans ce projet, nous étudions par cristallographie et cryo-EM la structure d'E6 liée à Ube3A, p53, aux motifs LxxLL, aux domaines PDZ et aux protéines 14-3-3. En utilisant nos approches d'interactomique quantitative, nous explorons l'interactome hôte d'E6, quantifions ses énergies de liaison et cherchons à comprendre comment l'interactome E6-hôte modifie l'interactome des protéines de l'hôte. Nous concevons et étudions, in vitro et in cellulo, des inhibiteurs recombinants d'E6. Nous résolvons également les structures de protéines E6 en complexe avec de petites molécules inhibitrices développées par l'Université d'Indiana.

2. Interactomique structurale de certains troubles du neurodéveloppement

Gilles Travé, Elodie Monsellier

Le développement et le fonctionnement du cerveau humain impliquent des réseaux protéiques complexes dont les énergies de liaison ont été finement optimisées. Lorsque, en raison d'altérations génétiques, un acteur protéique clé dans un tel réseau est absent, surexprimé ou muté, cela peut déséquilibrer ce réseau et conduire à un développement ou un fonctionnement cérébral sous-optimal, pouvant mener à un trouble du neurodéveloppement (TND). Ainsi, nous proposons de substituer la recherche traditionnelle de relations "gène-maladie" par l'étude de relations "interactome-maladie".

Nous explorons cette approche par l'étude des protéines Ube3A (~850 résidus), HERC2 (~4800 résidus) et CASK (~930 résidus).

Ube3A et HERC2 sont des E3 ubiquitine ligases de la famille des domaines HECT, qui interagissent mutuellement. Leurs gènes sont des voisins proches dans la région chromosomique 15q, et leurs altérations génétiques (mutation, délétion ou duplication) peuvent conduire à de graves TND tels que les syndromes d'Angelman, Angelman-like ou Dup15q. Dans ce projet, nous étudions par cristallographie et cryo-EM les structures d'Ube3A et HERC2, de leur interface de liaison, et de leurs complexes avec une variété d'autres protéines humaines. Nous explorons les interactomes d'Ube3A et HERC2 sauvages ou mutées, et quantifions leurs concentrations cellulaires et affinités de liaison. Nous effectuons également des études de localisation et co-localisation cellulaire, et vérifions si les plus forts et les plus pertinents partenaires de liaison sont également impliqués dans les TND, ce qui semble souvent être le cas.

CASK est une protéine d'échafaudage hautement conservée qui remplit de multiples fonctions dans et en dehors du système nerveux central, grâce à la variété des interactions protéine-protéine qu'elle établit à travers ses différents domaines. CASK est mutée dans plusieurs TND sévères tels que la déficience intellectuelle liée à l'X avec ou sans nystagmus (XLID), la déficience intellectuelle liée à l'X avec microcéphalie et hypoplasie pontique et cérébelleuse (MICPCH), entre autres. La grande variété des fonctions associées à CASK permet de multiples mécanismes pathologiques possibles qui restent mal compris. Néanmoins, la perte d'interaction de CASK avec certains de ses partenaires bien connus a été décrite pour plusieurs mutants. Dans ce projet, nous intégrons différentes méthodes interactomiques complémentaires pour générer un interactome contextuel et quantitatif de CASK. Nous quantifions également comment les variants pathologiques de CASK affectent cet interactome, et comment ces perturbations de l'interactome sont corrélées aux altérations phénotypiques. Nous espérons définir une empreinte pathologique des perturbations de l'interactome qui aidera à évaluer la pathogénicité des variants de signification inconnue (VUS), une question cruciale pour le diagnostic des TND.

3. Interactomique structurale des récepteurs nucléaires stéroïdiens

Isabelle Billas

Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription liés à l'ADN qui jouent un rôle clé dans la croissance cellulaire, la différenciation, le développement embryonnaire et le métabolisme. Leur particularité réside dans leur capacité à être activés par de petits ligands lipophiles, établissant ainsi un lien direct entre l'environnement cellulaire et la régulation des gènes. Notre recherche se concentre sur l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la régulation transcriptionnelle et la signalisation, avec un accent particulier sur les actions spécifiques aux tissus des récepteurs nucléaires stéroïdiens. Nos principaux sujets d'étude sont les récepteurs des glucocorticoïdes et des androgènes, ainsi que les récepteurs liés aux œstrogènes. La dérégulation de ces récepteurs est liée aux troubles métaboliques et au cancer. Nous utilisons une approche de biologie structurale intégrative, couplée à l'interactomique quantitative, pour étudier ces processus. Nos travaux sont complémentés par des analyses fonctionnelles menées sur des cellules et des modèles animaux, en étroite collaboration avec des biologistes moléculaires et des cliniciens.

Parallèlement, nous nous intéressons également à l'élucidation des forces évolutives qui dictent la fonction des protéines. En collaboration avec des biologistes évolutionnistes, nous avons apporté des contributions décisives à la compréhension de l'évolution de la dimérisation des récepteurs nucléaires et du couple hormone stéroïde-récepteur.

4. Développement d’approches pour la quantification à haut débit des affinités protéines-ligands

Elodie Monsellier

La description des interactomes cellulaires a été l'objectif de nombreuses études à haut débit au cours de la dernière décennie, aboutissant à l'identification de centaines de milliers d'interactions binaires. Chacune de ces techniques a ses propres forces et faiblesses, ce qui se traduit par un chevauchement relativement faible entre les interactomes publiés et une couverture encore largement incomplète de l'interactome humain. De plus, alors que les affinités peuvent s'étendre sur plusieurs ordres de grandeur et sont donc un paramètre essentiel des interactomes, les données produites par ces expériences à haut débit sont presque exclusivement qualitatives ("se lie" vs "ne se lie pas"). Ainsi, la description précise des réseaux d'interactions protéiques nécessite de nouvelles approches pour aborder les interactomes de manière quantitative, en mesurant les affinités à l'échelle du protéome.

Pour combler cette lacune, notre équipe a développé le Holdup, un essai chromatographique robuste et précis pour la quantification à haut débit des affinités protéine-ligand. Récemment, le couplage de notre méthode à une lecture par spectrométrie de masse a permis d'augmenter son multiplexage et de mesurer les interactions entre une protéine appât d'intérêt et des pools de milliers de proies potentielles en un seul essai. Différents types de proies ont été utilisés avec succès : des protéines entières issues de lysats cellulaires pour une approche de découverte, ou des pools de peptides / domaines protéiques pour quantifier les interactions entre zones d'interaction (approche fragmentomique). En étroite collaboration avec des équipes spécialisées en spectrométrie de masse, nous repoussons les limites de notre méthode en visant la meilleure robustesse, précision quantitative, couverture du protéome et débit possibles. Nous explorons également la diversité des ligands protéiques pour lesquels le Holdup peut quantifier les affinités : protéines mais aussi molécules d'ADN, d'ARN ou petites molécules. Enfin, nous nous intéressons également à évaluer la complémentarité du Holdup avec d'autres méthodes d’interactomique, afin de fournir une analyse rigoureuse de la façon dont ces différentes méthodes se complètent ainsi que de leurs biais potentiels.

5. Approches de ciblage et d'interactomique basées sur les ARN

Mariel Donzeau

Approche médiée par l'ARN pour une expression protéique intracellulaire homogène et ajustable. La transfection transitoire d'ADN étranger est la technique de laboratoire la plus largement utilisée pour étudier la fonction et le produit des gènes dans les cellules eucaryotes. Cependant, l'efficacité de transfection dépend de nombreux paramètres, notamment la quantité et la qualité de l'ADN, les méthodes de transfection et les lignées cellulaires cibles. Nous avons développé une méthode d'électroporation basée sur l'ARN, qui offre une efficacité de transfection extrêmement élevée. L'expression des protéines a lieu quelques heures après la transfection, dure au moins 48 heures et se produit de manière uniforme dans les cellules, avec une efficacité de transfection atteignant jusqu'à 98% des cellules dans la plupart des lignées cellulaires testées. Plus intéressant encore, le niveau d'expression des protéines peut être finement ajusté en modulant simplement les quantités d'ARNm transfectées. Nous développons davantage cette méthodologie en améliorant la stabilité des ARNm à l'aide de dérivés de NTP et en optimisant les régions 5' et 3' UTR. L'électrotransfert d'ARNm pourrait supplanter le système d'expression transitoire conventionnel basé sur l'ADN.

Développement du Holdup pour la détection et la quantification de l'affinité des complexes ARN-protéine et application aux ARNnc. Alors que 70 à 80% du génome humain est transcrit, seulement 2% code pour des protéines. La grande majorité du transcriptome humain est constituée d'ARN non codants (ARNnc). Les réseaux dans lesquels les ARNnc agissent comme régulateurs clés influencent un large éventail de cibles pour contrôler des réponses biologiques cellulaires spécifiques. En particulier, les ARNnc ont été identifiés comme des moteurs oncogéniques et des suppresseurs de tumeurs dans tous les principaux types de cancer. Deux groupes d'ARNnc ont été caractérisés, les petits et les longs ARNnc (respectivement ARNnc courts et longs). Les petits ARNnc, qui comprennent entre autres les micro-ARN, les petits ARN interférents et les ARN interagissant avec piwi, ont été largement étudiés. En revanche, on en sait beaucoup moins sur la fonction des longs ARN non codants (ARNlnc). Par conséquent, nous visons à comprendre les réseaux complexes d'interactions que les ARNlnc coordonnent dans le contexte cellulaire. À cette fin, nous développons une nouvelle version du Holdup qui étudie l'interactome protéique quantitatif de molécules d'ARNlnc d’interêt. Comme premier modèle, nous étudierons l'interactome de l'ARNlnc DINO (Damage Induced NOncoding lncRNA). DINO a été caractérisé comme une cible transcriptionnelle de TP53 et un modulateur fonctionnel qui provoque la réactivation de TP53 dans les cellules cancéreuses du col de l'utérus positives au HPV. Ainsi, l'interactome de l'ARNlnc DINO pourrait éclairer son rôle potentiel dans le développement des cancers positifs au HPV.

6. Interactomes quantitatifs, variations d’affinité et conséquences fonctionnelles

Gilles Travé, Elodie Monsellier, Yves Nominé

Les organismes vivants sont des systèmes hautement complexes de molécules en interaction, qui traversent des cycles très reproductibles d'auto-organisation et de réactions chimiques. Les énergies de liaison intermoléculaires (quantifiées par les constantes d'affinité de liaison, Kd) sont les potentiels d'interaction de ces systèmes. Chaque fois que les séquences génomiques intrinsèques varient, certaines molécules d'ADN, d'ARN et de protéines varient dans leurs potentiels d'interaction extrinsèques avec le reste du système. Selon la loi d'action de masse, cela doit impacter les concentrations relatives des divers complexes moléculaires formés, et donc l'organisation globale et l'ensemble des réactions effectuées par le système doivent également varier. Au final, cela doit moduler, voire parfois altérer, le comportement du système - en d'autres termes, ses fonctions biologiques ou ses traits phénotypiques. Comme décrit dans un autre paragraphe de notre page web, notre équipe développe des méthodes pour mesurer et quantifier toutes les énergies de liaison d'une molécule donnée de protéine, d'ARN ou d'ADN envers les autres molécules. De cette façon, nous obtenons des "profils de liaison" qui quantifient le potentiel d'interaction intrinsèque de chaque molécule de protéine/ARN/ADN de l'organisme étudié, envers toutes les autres molécules du système. De plus, les approches transcriptomiques et protéomiques donnent accès aux abondances/concentrations des molécules en interaction dans des populations cellulaires particulières (tissus, organes...) du même organisme.

Dans ce projet, nous mesurons les profils de liaison de grandes familles de molécules de protéines, d'ARN ou d'ADN, d'abord en utilisant leurs séquences de type "sauvage" trouvées le plus fréquemment dans la population humaine. Ensuite, nous remesurons les mêmes profils pour des séquences "variantes" particulières trouvées dans la population humaine. Comme les séquences variantes peuvent être catégorisées comme bénignes, probablement bénignes, pathogènes, probablement pathogènes ou de pathogénicité inconnue, nous choisissons généralement divers exemples parmi ces différentes catégories. Une fois les profils mesurés, nous appliquons d'abord la loi d'action de masse pour prédire comment les variations des énergies de liaison devraient affecter la proportion de complexes dans des exemples choisis de lignées cellulaires bien caractérisées. Ensuite, nous établissons des lignées cellulaires où les séquences de type sauvage sont remplacées par les variantes correspondantes, et mesurons les variations de traits phénotypiques quantitatifs entre les différentes lignées. Les traits phénotypiques quantitatifs que nous mesurerons systématiquement seront les protéomes et transcriptomes des différentes lignées cellulaires. Enfin, nous recherchons des corrélations potentielles entre les variations quantitatives des énergies de liaison des variants et les variations des traits quantitatifs exprimés par les lignées cellulaires variantes correspondantes. L'objectif final est d'étudier si les variations intrinsèques, basées sur la génétique, des profils de liaison peuvent être utilisées pour prédire les variations extrinsèques des phénotypes au sein de populations cellulaires complexes.

Sous-groupe(s)

Collaborations et réseaux

Renaud Vincentelli, AFMB, Marseille (France)

Christine Carapito, LSMBO, Strasbourg (France)

Etienne Coyaud, PRISM, Lille (France)

Søren Østergaard, Novo Nordisk, Maaloev (Denmark)

Elliot Androphy, Indiana University (USA)

Financements et partenaires

Ligue nationale contre le cancer (équipe labellisée)

Agence Nationale de la Recherche (ANR)

National Institute of Health (NIH)

Agence nationale de la recherche contre le Sida (ANRS)

Publications

Biologie structurale intégrative - Recherche contre le cancer